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北京协和医院发布-新型冠状病毒的核酸检测流程

北京协和医院发布了新型冠状病毒核酸检测标准操作流程(文末有协和医院发布详细文章及视频连接)


样本的核酸提取



A、手工核酸提取操作流程(以凯杰的52906柱提法核酸提取试剂盒为例)

       (1)裂解液配制:在基因扩增实验室的试剂配制区或单独的普通试剂配制实验室中,准备核酸提取所需的洗液1(AW1)、洗液2(AW2)和carrier RNA。按照要求,分别向洗液1和洗液2中加入分子生物学级别的130ml和160ml的无水乙醇并及时做好标记;取310μl洗脱液(AVE)溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后,通过传递窗进入核酸提取区或由工作人员送入核酸提取专用实验室。

       (2)样本裂解:取560μl AVL裂解液到1.5ml无菌EP管中,加入5.6μl配制好的Carrier RNA,再加入已经灭活的140μl样本(例如咽拭子、血浆等),混匀振荡15秒,室温静置10分钟,充分裂解样本中的核酸。将EP管瞬时离心后加入560μl无水乙醇,充分混匀15秒,再次瞬时离心后备用。吸取630μl裂解产物,小心加入至离心柱中,8000rpm(或6000g)离心1分钟,转移离心柱至新收集管,将剩余630μl裂解产物加到离心柱中,重复上一离心操作(若样本体积大于140μl,则在此步骤重复将630μl裂解产物过滤收集在一个离心柱上)。

       (3)核酸的洗涤:取500μl洗液1(AW1)至离心柱中,8000rpm(或6000g)离心1分钟;换新收集管后,取500μl洗液2(AW2)至离心柱中,8000rpm(或6000g)离心1分钟;换新收集管后,用14000rpm(或20000g)离心3分钟,去除洗液2(AW2);换新收集管后,继续用离心机最大转速(20000g)离心1分钟,充分甩离残留的洗液2(AW2)。

       (4)核酸的洗脱和回收:取一1.5ml无菌EP管,将离心柱放入其中,加入洗脱液(AVE)40~60μl,室温静置1分钟后,用8000rpm离心1分钟回收核酸,以备PCR检测使用。


2.要点提示:

       ●新鲜裂解液的配制应尽可能在专门的洁净区域或单独的实验室进行。

       ●要用分子生物学级别的无水乙醇试剂进行配制。

       ●向离心柱中加入裂解产物、洗液时操作要非常小心,尽量将洗头下探到离心柱内部后靠管壁加样,切忌出现溢洒后污染到离心柱的密封圈,这可能会导致乙醇残留,抑制后续PCR反应。离心操作时尽量选择支持生物安全的离心机例如AG手机客户端最新版本 - 首页生产JIDI-18H或JIDI-18RH

       ●从离心机中取出离心柱时应小心操作,避免离心柱下缘被收集管中的滤过残液污染。

       ●加入洗液2(AW2)后的第二次空管全速离心非常关键,能帮助充分甩离离心柱滤膜中残留的洗液2残液,确保洗脱核酸的纯度。

       ●洗脱液加样时需小心操作,确保洗脱液尽可能覆盖全部离心柱滤膜,充分洗脱核酸,提高核酸提取的产量。

       ●手工核酸提取可优选使用检测试剂盒说明书推荐的配套手工提取试剂,也可选用通用手工提取试剂。

       ●样本处理过程中,工作人员觉得有必要时,应随时更换新的外层乳胶手套。

       B、采用核酸提取仪提取核酸的操作流程

       根据核酸提取仪和试剂的说明书准备好提取试剂,取200μl样本上机提取核酸,并按照要求回收提取好的核酸备用。

       2.要点提示:

       ●不同的提取仪器和试剂的提取效率可能存在差异,请一定严格按照提取试剂盒的说明书进行核酸提取操作。

       ●有条件时可以考虑配备小型化的核酸提取仪在安全柜内使用,以进一步加强生物安全防护;若使用在安全柜外的核酸提取仪,则一定要做好生物安全防护及样本的防污染保护。

全面解析 | 北京协和医院2019新型冠状病毒的核酸检测流程
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